如何做Western blot?详细步骤来啦!
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如何进行Western blot实验？这里有一系列详细步骤：
首先，了解SDS-PAGE的基本原理。这是一种电泳技术，利用SDS和聚丙烯酰胺凝胶对蛋白样品按分子量大小进行分离。SDS-PAGE有三个关键效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
步骤一：准备凝胶。将玻璃板清洁、干燥后，用ddH2O检查密封性。然后配制上下两层凝胶溶液，分别加入适量的促凝剂，并根据凝胶厚度注入玻璃板，凝固后处理上层胶。
步骤二：进行电泳与转膜。将蛋白样品变性后，与loading buffer混合，按指定比例加入跑胶缓冲液，进行电泳。上样时需确保样品均匀分布，避免气泡。转膜时，先浸膜、浸滤纸，然后用三明治结构固定在转膜槽中，加入transfer buffer，低温转膜并封闭。
注意事项包括：转移缓冲液需现配，甲醇不可少；大分子蛋白需低浓度凝胶；尽量消除气泡，确保蛋白与膜的良好结合。
最后，加抗体显影。先用一抗孵育膜，然后是二抗，显影后保存结果。一抗和二抗浓度、孵育时间等需根据实验要求调整，以提高检测的特异性。
在整个过程中，细心操作和遵循每一步的注意事项是保证Western blot实验成功的关键。
