定位克隆基本步骤
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克隆定位的基本步骤包括基因组定位、候选cDNA的获取以及全长及功能分析。这个策略在基因研究中扮演了重要角色，特别是对于肿瘤易感基因的发现。
基因组定位的新方法主要通过PCR检测杂合性丢失(LOH)或纯合性丢失的高频率区，从而识别出可能的疾病相关基因。体细胞抑癌基因的失活是癌症发生的关键因素，LOH通常发生在包含抑癌基因的染色体区域。通过检测多个肿瘤样本的染色体缺失情况，可以精确定位这些负因子，如乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因，或者胰腺癌的DPC4基因。FISH技术、染色体显微切割和RH谱的发展，大大提高了定位的效率和精度。
候选cDNA的获得依赖于基因组定位的标记，通过PCR或克隆技术从YAC、BAC或PAC库筛选。虽然YAC库存在嵌合性和操作复杂性的问题，但BAC和PAC系统因其稳定性、操作简便性和大容量插入片段而更受欢迎。通过这些克隆，可以采用不同方法如cDNA文库筛选、特征序列分析或表达性质来获取候选cDNA。
全长及功能分析阶段，需要通过克隆全长基因并检测其在家系中的变异，以及进行功能研究。功能分析可能包括细胞水平的变化研究、个体基因敲除实验等。结合其他技术，如差减杂交，可以提高筛选有价值基因的成功率。随着转录图谱的发展，直接进行功能研究和全长克隆的可能性越来越大，这有望缩短定位克隆的周期，加速疾病基因的克隆进程。
扩展资料
从染色体上已知位置出发，克隆或鉴定遗传疾病相关的未知功能基因的技术。
