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近几年来，随着质谱仪器的不断更新换代，蛋白组学的技术也不断的革新，越来越多的科研工作人员加入到蛋白组学的研究热潮中。从最早的2-D电泳技术到基于LC-MSMS的蛋白定性；从Labelfree 技术到 标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术及PRM/MRM技术。每一次的技术革新都给我们这些研究蛋白组学的“莘莘学子”们开拓一片新的领域。
蛋白组学的应用技术非常多，每种技术都有自己的技术特点。目前研究的热点莫过于同位素标记定量iTRAQ/TMT技术，那么DIA/SWATH技术及PRM/MRM技术是怎么在这些技术当中实现 “异军突起”呢？
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当下研究蛋白组学，应用最广泛的技术---同位素标记定量（iTRAQ/TMT技术）。 iTRAQ/TMT技术利用的用DDA扫描模式，其扫描的方式是将一级质谱信号最强的Top 20的多肽进行二级打碎，然后进入二级质谱进行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同一条多肽，有利于后续的定性分析，但这种采集方式会忽略一些肽段的信息；而且对于大样本量的组学实验，iTRAQ/TMT技术也存在一定的通量限制。那么有没有一种技术可以解决目前蛋白组学困局呢？
对于组学数据的验证，常规的方法有：PCR、RT-PCR、WB技术、Elisa技术等，但是对于蛋白组学的验证，RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求；WB技术和Elisa技术虽然在某种程度上解决了不同组学之间的尴尬，但是由于抗体的定制难度，在非模式物种中的应用一直没得到解决。在这样的一个基础上，DIA、PRM技术隆重登场...
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DIA技术
DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用DIA方法进行质谱数据采集，从而实现对样品中蛋白质的定性及定量，不同于传统的DDA技术，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。
图1 | DIA技术流程DIA优势及技术难点
DDA模式对肽段离子的选择具有限制性和随机性，存在较多的数据信息缺失，而DIA模式的目标则是获得完整的数据，实现蛋白质的深度覆盖和精准定量。此外在复杂样品中，二级信号的定量比一级信号更为灵敏（例如一级质谱信号可能存在相似质荷比离子的干扰）。DDA模式为一级质谱信号定量，而DIA模式为二级质谱信号定量，因此DIA模式的定量准确性和重现性都更好。
DDA模式下肽段分子和其二级碎片离子有着对应关系，通过对已知数据库的搜索匹配，即可得到样本中的肽段及相关蛋白质信息。而DIA模式下肽段离子与其碎片离子之间的直接关系丢失（DIA光谱中的碎片离子可能是由多个肽段离子），复杂的谱图仍然给后续的数据分析和统计学检验带来很多挑战。对此目前已有多个团队开发出DIA分析的软件，例如OpenSWATH和Skyline，这些软件通过建立样本的参考库，对色谱峰进行抽提并分析。此外也有研发团队提出不需要参考库的数据分析方法DIA-Umpire，通过对肽段离子和碎片离子的匹配合成产生虚拟谱图进而搜库分析。因此，DIA技术非常适合一次性获取数百上千种蛋白质更为全面信息（高覆盖率，高准确度，高重复性）的研究。
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PRM：平行反应监测(parallel Reaction Monitoring,) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。PRM技术基于Q-Orbitrap为代表的高分辨、高精度质谱平台（MRM技术基于SCIEX Triple Tof 系列质谱，以SCIEX-5600为代表），首先利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子，随后在collision cell 中对母离子进行碎裂， 最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。
图2 | PRM靶向定量蛋白质组学分析基本流程1、PRM技术跟MRM技术有什么区别，优势有什么？
PRM技术与MRM技术很相似。先说一下相同点，两种技术在一级质谱中筛选目标蛋白的原理是一样的，都是通过四级杆进行母离子的筛选从而进行下一步的检测；不同点也很容易理解，MRM技术是在母离子碎裂后检测特异的子离子，通过母离子-子离子这种一一对应的离子对形式进行蛋白的定性定量，PRM技术是在母离子碎裂后通过高分辨检测器对全部子离子进行检测，这是PRM技术与MRM技术的不同。由于二级质谱检测模式的不同，在准确定性定量上，PRM技术比MRM技术更为准确，受到的离子干扰远小于MRM技术。
PRM技术的优势是更加简便，只需选择出母离子的质荷比，电荷数即可进行检测，不需要寻找准确的母离子-子离子对进行检测。
2、PRM实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器，检索的软件及常用数据库有哪些？
实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、除盐，冻干机冻干；高分辨 LC-MS/MS 质谱DDA检测，搜库定性，选择母离子，高分辨 LC-MS/MS 质谱PRM检测，定量分析，完整报告整理。
目前鹿明生物的质谱仪器有：AB公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive。
常用的检索软件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。
常用的数据库有：Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。
PRM数据处理软件：skyline