赵玉娇;蔡路奎;王晓丹;席珏敏;陈俊英;潘玥;邱丽娟;姜黎明;孙强明
【摘 要】目的 设计和筛选对入PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂. 方法 根据具有免疫刺激活性的CpG ODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰.分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpG ODN进行体外刺激,MTT法检测CpG ODN诱导细胞增殖水平.随后将筛选出的有效CpG ODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性. 结果 在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB-AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近.综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂.同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50％ ～65％,此外其部分序列与入18号染色体上的一些重复序列有同源性,最高同源性达62％.证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB-AC5安全性较高.结论 设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列IMB-AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础. 【期刊名称】《医学研究杂志》 【年(卷),期】2016(045)005 【总页数】6页(P37-42)
【关键词】CpG;ODN;佐剂;免疫刺激活性;同源性
【作 者】赵玉娇;蔡路奎;王晓丹;席珏敏;陈俊英;潘玥;邱丽娟;姜黎明;孙强明 【作者单位】650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;650118昆明,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 【正文语种】中 文 【中图分类】R3
目前市场上预防用疫苗大部分使用氢氧化铝[Al(OH)3]作为佐剂。铝佐剂被称为抗原仓库，能包裹抗原并缓慢地释放，起到贮藏的作用，且推迟抗原清除的时间，延长抗原暴露于免疫系统的时间，同时活化补体，提高淋巴结诱捕能力和淋巴细胞的滞留时间。此外还能吸附抗原并转运抗原至淋巴结，增强Th2类免疫应答和体液免疫。但其存在不能诱导产生Th1细胞免疫反应，阻断CD8+CTL的激活等缺点[1，2]。
CpG 寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide, CpG ODN)作为一种新型佐剂，与其他佐剂相比具有许多优点：CPG ODN本身无免疫原性，不会诱发自身免疫反应；CPG ODN合成及纯化能进行标准化生产，极其稳定，半衰期长达几年；疫苗配伍安全性高，能通过任何途径给药等，是一种非常有效和良好耐受的新型疫苗佐剂[3～5]。但目前公布的CpG ODN佐剂大多受专利保护，因此筛选拥有自主知识产权的有效CpG ODN佐剂对新型疫苗的研发具有重要意义。
根据CpG ODN的结构和在体外对人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)刺激作用的不同，可将具有免疫刺激作用的CpG ODN分为3种类型：A型：部分硫代修饰，5′和(或)3′端多有poly-G，非常稳定的、有序的高级结构(G-四聚体)，能刺激人pDC产生大量IFN-α，并能强烈激活NK细胞；B型：全部硫代修饰的骨架，含有1个或多个CpG基序，没有poly G，不形成典型的高级结构，能刺激B细胞增殖并分泌大量免疫球蛋白、白介素IL-6和IL-10，并能刺激pDC成熟；C型：全部硫代修饰，含有1个或多个CpG基序，无poly G结构，5′端含有刺激能力强的基序GTCGTT，序列中含有回文结构，兼有A型和B型CpG ODN的作用特点[6,7]。
总结目前作为疫苗佐剂进入临床的CpG ODN序列，均属于B型结构[8,9]。本研究通过查询和比较已有专利保护的B型CpG ODN序列，依据B型CpG ODN结构特点，设计和筛选具有良好免疫刺激活性的疫苗佐剂候选序列，为进一步研发拥有自主知识产权的新型佐剂疫苗奠定基础。
1.实验材料：RPMI-1640 培养液(Sigma产品)含L-谷氨酰胺、10%小牛血清、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇, 4℃储存备用；MTT(Sigma产品):用PBS 配成质量浓度为5mg/ml的液体, 过滤除菌, 4℃储存备用；淋巴细胞分离液购自深圳市达科为生物技术有限公司；CpG ODN序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HPLC纯化，硫代修饰。
2.CpG ODN序列的设计原则：总结国内外研究资料，具有免疫刺激活性的CpG ODN序列基本结构有以下特点：①CpG基序是CpG ODN产生免疫刺激作用的基本结构，由CpG二核苷酸及其5′端和3′端的各两个碱基构成；②CpG两侧的嘌呤和嘧啶以及CpG的间隔都会影响CpG ODN的免疫刺激活性及其作用特点；③ODN所含CpG基序的数目，通常含有2～4个CpG基序是最佳的，CpG基序间的间隔，通常至少要间隔两个碱基，而且最好是胸腺嘧啶；④含有poly-G序列(3个或以上鸟嘌呤组成)的CpG ODN具有较强刺激浆细胞样树突状细胞产生干扰素-α(IFN-α)的作用；全部硫代修饰的CpG ODN最稳定，且对B细胞的刺激作用最佳，但全部硫代修饰的CpG ODN刺激pDC产生IFN-α的作用却不及部分硫代修饰的CpG ODN。以上述结果为依据，共设计15条CpG ODN序列，分别合成硫代和非硫代2种形式。
3.CpG ODN含量测定：将合成的CpG ODN短暂离心后置于冰盒上，以标注的吸光度值A用去离子水稀释至20～30μg/ml作为供试品。为测定CpG ODN含量，置供试品于UV-2501紫外分光光度计中，以波长260nm进行检测，根据供试品的吸光度值计算待检样品的含量：待检样品含量(μg/ml)=A供试品×33×稀释倍数(33：单链寡脱氧核苷酸当A260=1时，为33μg/ml)。
4.以人PBMC筛选具有免疫刺激活性的CpG ODN序列：人PBMC中含有丰富的T、B淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，这些免疫细胞是人体应对外来病原体感染的主要功能细胞。以Ficoll分离液将人PBMC从新鲜全血中分离，悬于含10%FBS的1640培养基中， 接种于24 孔板，5×105个细胞/孔。将合成的CpG ODN序列用去离子水稀释后以20μg/ml的终浓度加入PBMC细胞作为刺激物，每个序列设3个复孔。于37℃、5%CO2 培养72h后以MTT法检测CpG ODN 诱导PBMC细胞增殖水平，对自行设计的CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。
5.以小鼠脾细胞筛选具有免疫刺激活性的CpG ODN序列：选4～6周龄雌性Balb/c小鼠，脱颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡3min，无菌操作取出脾脏。将脾剪为连体4段，放置在70μmol/L筛网上，筛网放置10ml培养板中，培养板中提前加入10ml IMDM-2，用无菌注射器内芯轻轻研磨，磨完后，脾细胞悬液过滤至15ml离心管，接种于24 孔板，5×105个细胞/孔。将合成的CpG ODN序列用去离子水稀释后以20μg/mL的终浓度加入脾细胞作为刺激物，于37℃、5%CO2 培养72h后以MTT法检测CpG ODN 诱导小鼠脾细胞增殖水平，对CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。
6.CpG ODN佐剂序列与人类基因组序列同源性比较：为了比较CpG ODN佐剂序列与人类基因组序列是否具有同源性。采用目前所通用的核酸序列同源性检索方式，利用GenBank数据库中收录的EST序列进行同源性检索，检索与其同源的核酸序列。典型分析是采取NCBI的Blast软件对GenBank中的非冗余数据库进行查询。该数据库是对GenBank EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列进行整合后所得的最为全面的已知基因数据库。在Blast里选择人类基因组，再选择Highly similar sequences(megablast)进行比对。
7.统计学方法：数据结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，CpG ODN供试品浓度与标准浓度间的差异以标准偏差计算；MTT法检测结果中各组A值采用单因素方差分析，数据以均数±标准差±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。 1.CpG ODN序列的设计与合成：根据CpG ODN序列设计原则，共设计合成15条候选CpG ODN序列(表1)。每条分别合成硫代修饰和非硫代修饰各100A，HPLC纯化(纯度达99%以上)。同时合成目前已获批进入Ⅲ期临床的Dynavax公司CpG ODN佐剂ISS1018作为阳性对照。
2.CpG ODN序列的溶解及浓度测定：首先参考标注含量将合成的CpG ODN以
去离子溶解成30μg/ml浓度，然后通过分光光度法测量及计算CpG ODN含量。结果显示根据合成公司提供的A值进行溶解，非硫代和硫代CpG ODN溶解后浓度与理论浓度(30μg/ml)差异较大(标准偏差达2.0373和1.6994)。为保证供试品中CpG ODN含量无显著性差异，根据检测结果以去离子水稀释，调整浓度到20μg/ml，再次测量其浓度。经统计学分析，非硫代和硫代CpG ODN供试品浓度与标准浓度(20μg/ml)间的标准偏差为0.2926和0.3256，差异显著小于初次溶解后浓度的差异。
3.不同CpG ODN序列对人PBMC免疫刺激活性比较。利用设计出的不同CpG ODN序列对人PBMC进行体外刺激，用MTT 法检测各组A值。结果显示，15 条非硫代序列中, 各CpG ODN的A值均高于阴性对照组，其中3、5、11号序列A值分别达到0.359、0.377和0.365，与阳性对照ISS1018序列A值(0.387)接近，显示出较好的针对人PBMC的免疫刺激作用。硫代修饰的15条序列中，3、5、9、11、14号序列A值均明显比其他序列高，分别达到0.320、0.334、0.334、0.336和0.339，与阳性对照ISS1018序列A值(0.338)接近(图1)。 4.不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞免疫刺激活性比较：分离4～6周龄雌性Balb/c小鼠脾细胞，利用设计出的不同CpG ODN序列对脾细胞进行体外刺激，用MTT 法检测各组A 值。结果显示，15 条非硫代序列中, 各CpG ODN的A值均高于阴性对照组，其中第5和11号序列A值分别达到0.571和0.509，与阳性对照ISS1018序列A值(0.588)接近，显示出较好的针对人PBMC的免疫刺激作用。硫代修饰的15条序列中，3、4、5、11、14号序列A值均明显比其他序列高，分别达到0.466、0.416、0.486、0.426和0.429，与阳性对照ISS1018序列A值(0.464)接近(图2)。
5.CpG ODN佐剂序列与人类基因组序列同源性比较：综合不同CpG ODN序列对人PBMC细胞和小鼠脾细胞免疫刺激活性比较结果，初步筛选出IMB- AC5序
列作为新型CpG ODN候选佐剂。为评估其安全性，将其序列与人类基因组序列进行同源性比较。比对结果显示， CpG ODN佐剂IMB-AC5总共23nt，与人的基因序列没有同源性，与部分蛋白编码基因的同源性只有50%～65%。此外其部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性，最高同源性达62%，比对结果如图3所示，证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB- AC5安全性较高。 从CpG ODN佐剂成功运用于乙肝疫苗，使部分对普通乙肝疫苗无免疫应答的人群产生保护后，CpG ODN佐剂成为了疫苗研发中的一大热点[10,11]。大量研究表明，浆细胞来源的树突状细胞pDC经CpG ODN刺激后能分泌大量的IFN-α，后者使pDC向淋巴结的边缘区和外测T细胞区迁移和募集，进而更有效地刺激获得性免疫应答。CpG ODN通过激活TLR9信号，可以与B细胞抗原受体信号协同促进初始B细胞、已诱发B细胞和记忆性B细胞的激活，并进一步分化为分泌抗体分子的浆细胞。虽然除pDC和B细胞以外的免疫细胞不表达TLR9，不能直接被CpG ODN激活，但可以通过其诱生的细胞因子等被间接活化促进免疫反应，如增强T细胞受体介导的T细胞的活化；活化NK细胞，促进其杀伤靶细胞；诱导单核细胞CD40、CD69分子表达上调，并分泌高水平 IP-10、IL-6和TNF-α等。
本研究旨在设计和筛选出具有良好免疫刺激作用的CpG ODN佐剂，为研发具有自主知识产权的CpG ODN佐剂疫苗奠定基础。通过专利序列比对，在设计CpG ODN序列的过程中尽量避开国内外已申请专利保护的CpG ODN佐剂核心序列，如Coley公司于2000年申请的中国专利(专利号：00814840.6)《免疫刺激性核酸》，其中涉及核心免疫刺激序列5′X1X2TTTTX3X43′，其中X1、X2、X3、X4均为核苷酸，且可以为A、T、G、C任意组合。本研究设计的序列均未采用所述序列，不涉及知识产权问题。
人外周血单个核细胞(hPBMC)由T细胞、B细胞、单核-吞噬细胞、树突状细胞等
多种细胞组成。人体免疫系统中表达TLR9的主要是B 细胞和浆液样树突状细胞(pDC)，它们分别在适应免疫和固有免疫中占有重要地位。 B型和C型CpG ODN能促进B细胞增殖和分泌抗体，通过检测免疫调节活性。虽然CpG ODN仅作用于具有TLR9受体的细胞，但免疫系统的激活是由多种细胞协同作用产生的，因此采用人PBMC能客观的反映人体自然状态下的免疫反应。
由于CpG ODN两侧序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用。有研究表明，CpG ODN可表现出种属依赖性，即对一种动物表现免疫增强功能的CpG ODN，在另一种动物或人则未必表现出同样的或等效的免疫增强功能。因此本研究采用人PBMC和Balb/c小鼠脾细胞作为双重筛选依据，进行CpG ODN佐剂筛选。既考虑了种属特异性，又考虑到了筛选动物的敏感度及试验的便利性。
大量资料显示硫代修饰的CpG ODN序列一般会具有更强的免疫刺激作用。对比本研究中非硫代和硫代修饰的15条CpG ODN序列刺激人PBMC细胞和Balb/c小鼠脾细胞增殖作用效果，却发现非硫代的CpG ODN序列刺激效果普遍高于硫代修饰的序列，可见硫代修饰并非对所有CpG ODN佐剂具有增强作用，后续研究均拟采用非硫代CpG ODN序列进行。
为评估筛选出的在人PBMC细胞和Balb/c小鼠脾细胞上具有显著刺激作用的CpG ODN序列IMB- AC5作为人用疫苗的风险，笔者将其与人类基因组序列进行了同源性比较。结果显示，CpG ODN佐剂IMB-AC5与人的基因序列没有同源性，与部分蛋白编码基因的同源性只有50%～65%，部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性，但最高同源性只达62%，证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB-AC5安全性较高。但单纯性的同源性比较只能作为核酸佐剂安全性评估的参考而非标准，此序列作为人用疫苗佐剂的安全性仍需进一步证明。
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